分子（1 / 1）

等到佟玲跟李成方便出来，走廊里将响起上课铃声了，于是张慧就带着唐晶往教室走进去。等到响第二次铃声，生物老师陈跃进就拿着教案，将慢腾腾地走进324班教室，走到讲台前，一边放教案一边说：“同学们好！”“老师好！”“今天，给同学们讲DZA的粗提取鉴定，当你制作DZA的又螺旋结构模型，模拟DZA的复制，绘制DZA指导蛋白质合成过程后，对DZA的结构与功能一定有了不少的了解。但是，仅仅从课本上了解DZA，就像”雾里看花，水中望月。”总隔着一层。本课题为你提供了从生物体内直接提取DZA的机会。

一提取DZA的方法，提取生物大的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大。对于DZA的粗提取而言，就是要利用DZA与DZA，蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异。提取DZA，去除其他成分。首先，让我们来了解这些大的物理化学性质。

DZA的溶解性，DZA和蛋白等其他成分在不同浓度的DZA溶液中溶解度不同。利用这一点，选择适当的盐浓度就能使DZA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。图5~1是DZA在ZAC1溶液中的溶解度曲线，请根据曲线图，思考下面的问题。

一在什么浓度下，DZA的溶解度最小？DZA在NAC1溶解中的溶解度是如何变化的？二如何通过控制NAC1溶液的浓度使DZA在盐溶液中溶解或析出？此外，DZA不溶于酒精溶液，但是细胞中某些蛋白质则溶于酒精。DZA对酶，高温和洗涤剂的耐受性，蛋白酶能水解蛋白质，但是对DZA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60~80度的高温。而DZA在80度以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜（图5~2），但对DZA没有影响。

DZA的签定，在沸水浴的条件下，DZA遇二苯胺会被染成蓝色，因此，二苯胺可以作为签定DZA的试剂。

一实验材料的选取，什么样的实验材料适合提取DZA？原则上，凡是含有DZA的生物材料都可以考虑，但是，选用DZA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。下而的生物材料适合做DZA的提取吗？为什么？你打算选用什么实验材料？你也可以同时用2~3种实验材料，最后比较哪种材料中DZA的含量更高。

比如：鱼，猪肝，花菜，香蕉，鸡血，哺乳动物的红细胞，猕猴桃，洋葱，菠菜，在液体培养基中培养的大肠杆菌。

二破碎细胞，获取含DZA的滤液。动物细胞的破碎比较容易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌。过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶液溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DZA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分地搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。

在这一步的设计中，你可以通过设置对照实验来探究生物材料与洗涤剂，食盐用量的最佳比例，看看不同的用量比对结果会产生怎样的影响，你也可以探究用不同的洗涤剂，如洗发香波，沐浴液，洗洁精来提取DZA时，会产生什么不同的效果。

三去除滤液中的杂质，为了纯化提取DZA，需要将滤液作进一步处理。下面是去除杂质的三个方案，你可以根据实际情况选用一种或者自已设计一个方案。

方案一：利用DZA在不同浓度的NAC1溶液中溶解度的不同，通过控制NAC1溶液的浓度去除杂质，具体做法是：在滤液中加入NAC1，使NAC1溶液物质的量浓度为2MO/L，过滤除去不溶的杂质，再调节NAC1溶液物质的量浓度为0。14MO1/L，析出DZA，过滤去除溶液中的杂质。再用物质的量浓度为2MO/L的NAC1溶液解DZA。

方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉（图5~3），反应10~15MIN，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。

方案三：将滤液放在60~70度的恒温水浴箱中保温10~15MIN，注意严格控制温度范围。

最后说DZA的析出与签定，将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的，冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3MIN，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DZA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物（图5~4），并用滤纸吸去上面的水分。取两支20ML的试管，各加入物质的量浓度为2MO/L的NAC1溶液5ML，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向二支试管中各加入4ML的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5MYN，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DZA的溶液是否变蓝（图5~5）。

现在来操作提示：一，以血液为实验材料时，每100ML血液中需要加入3G柠檬酸钠，防止血液凝固。二，加入洗涤剂后，动作要轻缓，柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DZA的断裂，导致DZA不能形成絮状沉淀。三，二苯胺试剂要现配现用，否则会影响签定的效果。

结果分析与评价，1，你选用了什么实验材料？你采用了怎样的方法步骤？2，你提取出了白色丝状物吗？用二苯胺签定的结果如何？3，你能分析出粗提取的DZA中可能含有哪些杂质吗？4，与其他同学提取的DZA进行比较，看看实验结果有什么不同，分析产生差异的原因。

课题延伸：本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DZA时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。请查看资料，了解实验室提取纯度较高的DZA的一种方法，与本课题中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。

现在我接着说多聚酶链式反应扩增DZA片段，所以说多聚酶链式反应（POLYMERASECHAINREACTION。PCR）是一种体外迅速扩增DZA片段的技术，它能以极少量的DZA为模板，在几个时内复制出上百万份的DZA拷贝，这项技术有效地解决了因为样品中DZA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛地应用于遗传疾病的诊断，刑侦破案，古生物学，基因克隆和DZA序列测定等各方面。在本课题中，我们将了解PCR技术的基本原理，并尝试用PCR技术扩增DZA片段。

首先让我们来说PCR原理，在用PCR技术扩增DZA的复制过程与细胞内DZA的复制类似。因此，要了解PCR原理，首先要分析细胞内参与DZA复制的各种组成成分与反应条件。下表列出了DZA复制所需要的基本条件，想一想，如何在体外设置一个类似的DZA复制环境。DZA复制的具体过程涉及到DZA双链的方向。你已经知道，DZA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DZA的方向，通常将DZA的痉基（－OH）未端称为3端，而磷酸基团的未端称为5端。DZA聚合酶不能从头开始合成DZA，而只能从3端延伸DZA链。因此，DZA复制需要引物。当引物与DZA母链通过碱基互补配对结合后，DZA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DZA链，因此DZA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸（图5~6）。

在DZA的复制过程中，双链的解开是进行DZA复制的前提。如何在体外将双螺旋打开呢？这个过程可以通过控制温度来实现。在80~100度的温度范围内，DZA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性，当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DZA链又会重新结合成双链（图5~7）。PCR利用了DZA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实际上也是一台能够自动调控温度的仪器（图5~8）。

高温虽然解决了如何打开DZA双链的问题，但是，又导致了DZA聚合酶失活的新问题。在解决这个新问题之前，PCR还并非一种实用的实验方法。到20世纪80年代，耐高温的TAQDZA聚合酶的发现和应用（专题2课题2），解决了上述矛盾，大大增加了PCR的效率，使PCR技术趋向自动化，而最终成为现代生物学实验工作的基本方法之一。综合以上分析可以看出，PCR反应需要在一定的缓冲溶液（参见专题课题3）中才能进行，需提供：DZA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DZA聚合酶，同时通过控制温度使用DZA复制要体外反复进行。

PCR的反应过程，PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性，复性和延伸三步（图5~9）。在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大模板DZA彻底变性的慨率。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应。并且由引物1延伸而成的DZA单链会与引物11结合。进行DZA的延伸。这样，DZA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DZA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。

在PCR实验中，通常要用到微量离心管，它是一种薄壁塑料管（图5~8），总容积为0。5ML。具体操作时，用微量移液器（图5~10），按照旁栏的配方在微量离心管中依次加入各组分，再参照下表的设置设好PCR仪的循环程序就可以了。想一想，在PCR反应中，如何设置对照实验？

在做PCR报需要的实验材料可以直接从生物技术公司购买。如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为94度，55度，和72度，然后按照上表的要求，在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管即可。

为了避免外源PCR等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管，枪头，缓冲液以及蒸馏水等使用前必须进行高压灭茵。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在—20度储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿来出，放在冰块上缓缓融化。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约为10S，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。

结果分析与评价，PCRD在260NM的紫外线波段有一强烈的吸收铎（图5~11）。可以利用PCR的这一特点进行PCRWY含量的测定，具体方法如下，1，将样品进行50倍稀释：取2ULPCR反应液，加入98UL蒸馏水。2，以蒸馏水作为空白对照，在波长260NM处，将紫外分光度计（图5~12）的读数调节至零。3，加入步骤1中的PCR稀释液100UL，至比色杯中，测定260NM处的光吸收值。4，根据下面的公式计算DZA含量。DCA含量（UGML）=50X（260NM的读数）X稀释倍数，通过上术方法，你能估算出DZA片段的含量比扩增前增加了多少倍吗？

课题延伸，完成本课题后，你也许会觉得PCR的原事虽然复杂，但操作却十分简单。快速，高效，灵活和易于操作正是PCR的突出优点。到目前为止，人们已从基本的PCR方法中衍生出许许多多的新方法。许多科普杂志和专著致力于介绍这些新方法。请你查阅相关资料，了解这些方法的具体应用。好了，今天就讲到这里，下课。”因为教室门外走廊里，将响起下课铃声，于是陈跃进拿起教案，往教室门外走出去。

可是同学们听到下课了，一时间，都露出自由的微笑。紧接着，同学们一边收拾课本一边往教室门外走出去方便，于是，走廊里，洗手间，都是男生跟女生的身影，是来也匆匆去也冲冲。

;